Work in progress!
As mensagens estão sendo editadas para criar uma curta (e modesta) revisão sobre cultura de tecidos.
Obs: não sou experiente em matéria, só estou lendo sobre o assunto e criando este guia para me orientar e, se possível, ajudar os outros membros do fórum.
A CULTURA IN VITRO DE SEMENTES E TECIDOS VEGETAIS, em três palavras
A cultura in vitro permite crescer sementes e tecidos vegetais em condições de abundância de nutrientes - não somente nitrogênio, potássio e fósforo, mas também com grandes quantidades de fontes imediatas de energia, geralmente açucar (sacarose). Para evitar que o sacarose promova o crescimento de bactérias e mofos, a cultura deve ser realizada em condições estéreis e controladas -ou seja, in vitro.
As vantagens da cultura in vitro podem ser resumidas em produzir:
-rapidamente
-grandes quantidades
-de plantas idénticas às originais.
Nem sempre o cultivador é interessado às três vantagens: quem cultiva de sementes certamente quer que as plántulas se desenvolvam rapidamente, mas não está criando plantas geneticamente idénticas - aliás, pode estar torçendo para que algumas delas tenham características novas e valiosas.
Se quiserem dar uma olhada, >este blog< mostra a incrível velocidade de crescimento de um explante de Dionaea "cupped trap" e de seedlings de várias espécies de plantas carnívoras.
O cultivo celular é geralmente realizado em três etapas
-a primeira é o estabelecimento, a partir de sementes ou tecidos não estéreis, do cultivo em meio rico de nutrientes, sem contaminação por nenhum microorganismo;
-a segunda é o crescimento e a propagação das plantas;
-a terceira é a preparação das plantas para a transferência para substrato ou terreno "normal".
A ESTERILIDADE
Por causa da grande quantidade de açúcar no meio de cultivo, a técnica só pode ser realizada em condções de total ausência de microorganismos. Caso contrário, o meio de cultivo seria tomado pelos microorganismos em poucos dias (bactérias) ou poucas semanas (fungos/mofos), com perda da planta (ver de novo o >blog<).
Isto indica a necessidade de:
-uma metódica de esterilização de meios, instrumentação, frascos de cultivo, etc.;
-uma metódica de esterilização das sementes e tecidos;
-uma área estéril para manuseio dos tecidos após esterilização e das plantas em cultivo.
Estas necessidades são atendidas com facilidade em laboratórios de pesquisa, no caso da esterilização, por meio de >autoclaves< e no caso da área estéril, por meio de >capelas de fluxo laminar<. Em casa, devemos utilizar recursos mais simples.
O autoclave é basicamente uma grande panela de pressão, que atinge pressões controladas de até 130-140C. A esterilização é feita em 121C por 20 minutos, ou 131C por 15 minutos. Nas panelas de pressão comuns, a pressão atingida é geralmente menor, cerca de 110-115C. Assim é possível usá-las para esterilizar instrumentação, meio de cultivo e frascos, mas o tempo de esterilização deverá ser maior (30-35 minutos). CUIDADO! É fundamental lembrar que qualquer tipo de recipiente não poderá ser colocado fechado na panela de pressão: por um lado, a fechadura ão permite ao vapor entrar no recipiente para esterilizá-lo, e por outro lado, existe risco de explosão (ou implosão) durante ou depois a esterilização. Os recipientes devem ser colocados parcialmente abertos, e deverão ser fechados logo após a abertura da panela para preservar a esterilidade. Outra possibilidade é o uso de forno microondas, mas eu não aconselho: a chance de contaminação vai ser maior, e também a chance de fazer melecas com o meio e cultivo.
A capela de fluxo laminar é uma mesa para trabalho estéril, em cima da qual é continuamente jogado ar estéril. Assim, qualquer recipiente aberto em baixo do fluxo de ar estéril não será contaminado por microorganismos. Embora existam sugetões para construir capelas de fluxo laminar caseiras (>aqui<), o sistema mais comum para se trabalhar em casa em condições decentes (nunca vai ser estéril de verdade, mas tem boas chances de não contaminar os frascos) é utilisar uma estrutura em plástico, fechada, e borrifá-la com hipoclorito (e borrifar tudo que seja introduzido embaixo dela, inclusive as luvas do operador) para eliminar miroorganismos. Para que isto der certo, é importante trabalhar num quarto limpo, em ausência de qualquer movimentação de ar (janelas abertas, pessoas caminhando). Para exemplos, ver >este vídeo< ou estes sites (1) (2).
Sobre esterilização de sementes e tecidos, a opção mais simples é o uso de álcool/H2O2/hipoclorito. Outras opções são o NaDCC (dicloroisocianurato de sódio, ou dicloro-s-triazinatriona de sódio) e o PPT (5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona + 2-metil-4-isotiazolin-3-ona). Falarei mais sobre isto na parte técnica do guia.
